Nobelio premija chemijoje - 2017 m. • Arkadijus Kuramšinas • Mokslo naujienos apie "Elementus" • Nobelio premijos, mikrobiologija, molekulinė biologija, technologijos

Nobelio premija chemijoje – 2017 m

Pav. 1. Nobelio premijos laureatai chemijoje 2017 m. Iš kairės į dešinę: Jacquesas Dubose, Joachimas Frankas ir Richardas Hendersonas. Nuotraukos iš sciencenews.org

Praėjusią savaitę buvo paskelbta, kad Nobelio premija už chemijos 2017 gaus Šveicarijos Jacques Dyuboshe, yra vokiečių kilmės Joachim Frank JAV ir škotas Richard Henderson, skirta "kurti metodus cryoelectron didelės skiriamosios gebos mikroskopu nustatyti trimates struktūras biomolekulių tirpale." Jų darbas leido nuo praėjusio šimtmečio 80-ųjų išbandyti ir palaipsniui tobulinti tokios rūšies mikroskopą tokiu mastu, kad pastaraisiais metais mokslininkai gali ištirti sudėtingas biologines molekules mažiausiu detaliu. Nobelio komitetas pažymėjo, kad krioelektroninės mikroskopijos metodas pakeitė biochemiją į naują erą, leidžiančią užpildyti daugybę žinių apie gyvenimo molekules ir gyvenimo sistemas.

Nobelio komitetas laikėsi nuomonės, kad didžiausias indėlis į cryoelectron mikroskopijos plėtra – metodą aiškiai matyti sudėtingą struktūrą baltymų, nukleino rūgščių ir kitų molekulių, taip pat studijuoti procesus, kuriose jos dalyvauja, turi Šveicarijos Jacques Dyuboshe (Žakas Dubochet), vokiečių-amerikiečių Joachimas Frankas ir šokas Richardas Hendersonas.

Iš karto pastebime, kad kriogeninės elektroninės mikroskopijos sunku vadinti iš esmės naują ir savarankišką medžiagos fizikinių tyrimų metodą. Priešingai, tai transliuojančiosios elektroninės mikroskopijos tipas (vienas iš šio metodo autorių, Ernstas Ruska, 1986 m. Gavęs Nobelio premiją), kuris buvo specialiai pritaikytas studijuoti mikrobiologinius objektus.

Pav. 2 Krioelectron microscope įdiegta Šiaurės vakarų universitete, JAV. Nuotraukos iš "vox.com"

Transliuojančiojo elektroninio mikroskopo mėgintuvėlis, kuris yra skaidrus elektronams (dažniausiai dešimtadalis ir šimtai mikronų), patenka į elektroną per pakankamai ploną elektroną, kuris, praeinant pro pavyzdį, absorbuojamas ir išsklaidomas, keičiant judėjimo kryptį. Šie pokyčiai gali būti užregistruoti (dabar CCD matrica, kuriai kūrėjai, Willard Boyle ir George Smith, laimėjo Nobelio premiją fizikos 2009 m.) Dažniausiai naudojamos ir po analizės gauti tyrimo objekto vaizdą plokštumoje, statmenoje šviesai. Kadangi vidinis elektronų bangos ilgis (dešimtys pikometrų esant energijomsbūdingas elektronų mikroskopams) yra daug mažesnis nei šviesos bangos ilgis matomoje zonoje (šimtai nanometrų), naudojant elektroninę mikroskopiją galima "pamatyti" daug smulkesnių detalių nei naudojant optinę mikroskopiją, įskaitant didelės skiriamosios gebos fluorescencijos mikroskopiją (FVRM), sukurtą 2014 m. Nobelio premijos laureatai chemijoje, Ericas Betzigas, Stefanas Khelmes ir Williamas Merneris.

Elektroninių mikroskopų riba – kelios angstroms (dešimtosios nanometro) – beveik pasiekta. Tai leidžia gauti vaizdus, ​​kuriais, pavyzdžiui, atskiriami atskiri atomai. Palyginimui: fMBP galimybių riba yra 10-20 nm. Tačiau tiesiog palyginti skirtingus galutinio sprendimo būdus yra gana nereikalinga. Elektroniniai mikroskopai turi didelę skiriamąją gebą, tačiau jų ne visada galima naudoti. Faktas yra tai, kad bandinys, be šlifavimo preparato metu, per tyrimą patiria rimtą apšvitinimą elektronų pluoštu (maždaug tuo labiau, kuo intensyvesnis pluoštas, tuo mažiau klaidų ir tuo geriau rezultatas), o vakuume (reikalingas vakuumas terpė neišskleidžia elektronų už bandinio, todėl sukelia nereikalingus iškraipymus).Tokios sąlygos yra visiškai netinkamos, jei jums reikia mokytis sudėtingų biologinių molekulių ir objektų – jie yra sugadinti ribotos aplinkos ir yra daug gana silpnas ryšius, kurie tiesiog žlugdys per tyrimą.

Supratimas, kad be papildomų patobulinimų elektronų mikroskopas negali būti pritaikytas biomolekulių ir gyvų sistemų tyrimui, pasirodė beveik iš karto po jo išradimo. Pavyzdžiui, apie tai rašė praėjus trims metams po to, kai 1931 m. Ernesto Rusko elektroninio mikroskopo veikimo principas buvo įrodytas Vengrijos fizikė Ladislav Marton (L. Martonas, 1934 m. "Biologinių objektų elektroninė mikroskopija"). Tame pačiame straipsnyje Martonas pasiūlė šios problemos sprendimo būdus. Visų pirma jis taip pat pažymėjo, kad šaldymo mėginiai gali sumažinti žalą, kurią sukelia elektronų spindulių spinduliavimas. Svarbu pažymėti, kad, nors Marton straipsnyje to nenurodo, mėginio užšalimas taip pat padeda mažinant molekulių šiluminę vibraciją, o tai taip pat padeda pagerinti susidariusį vaizdą.

1970 m. Ir devintajame dešimtmetyje mokslas ir technologijos pasiekė pakankamą išsivystymo lygį, kad įveiktų visus sunkumus. Tai daugiausia lėmė šių metų apdovanojimų laureatų pastangos.

Richardas Hendersonas pirmasis gavo asimetrinio baltymo vaizdą, turintį atominę sklaidą, naudojant perdavimo elektroninę mikroskopiją (su mėginio aušinimu). Jis pradėjo savo tyrimus septynerių metų viduryje. Iš pradžių Henderson bandė gauti iš kelių ląstelių membranos baltymų struktūrą, taikydamas rentgeno analizės metodą, kuris net ir tada galėjo suteikti kelias angstromas. Tačiau greitai paaiškėjo, kad šis metodas nepasiekė gero rezultato: tiriamoji medžiaga turėtų būti kristalinės formos, o iš jų aplinkos ištraukiami membraniniai baltymai silpnai kristalizuojasi arba visai prarandami. Tada jis perėjo prie elektroninės mikroskopijos.

Buvo pasirinktas specifinis baltymas – bakterihorodopsinas – nuspręsta jo ne išgauti iš membranos, bet tiesiogiai jį ištirti. Mokslininkai papildomai padengė mėginius gliukozės tirpalu, kad apsaugotų jį nuo džiūvimo vakuume. Tai padėjo išspręsti struktūros išsaugojimo problemą. Tuomet Hendersonas ir jo kolegos susidūrė su jau aprašyta mėgintuvėlių sunaikinimo problema, veikiant elektronų pluoštui.Tai padėjo išspręsti keletą veiksnių derinį.

Pirma, bakterihorodopsinas reguliariai yra membranoje, todėl kruopštus šio reguliarumo vertinimas kartu su fotografavimu iš skirtingų kampų labai padeda fotografuoti. Tai padėjo sumažinti šviesos intensyvumą ir sumažinti ekspozicijos laiką, bet ir pagerinti kokybę. Jau 1975 m. Buvo įmanoma gauti šio baltymo vaizdą su 7 angstrų raiška (3 pav. Žr. R. Hendersoną, P. N. T. Unwin, 1975. Trimatis violetinės membranos modelis elektronine mikroskopija).

Pav. 3 Kairėje: vienas iš pagrindinių bakterinės membranos "fotografijų" Halobakterio halobijagautas Henderson grupės. Juodos linijoskaip matiniai plaukai yra bakterihorodopsin molekulių pėdsakai. Matoma, kad jie daugiausia nukreipti statmenai vaizdo plokštumai. Taškinė linija apverčia apytikriai ribą vienos šio baltymo molekulės. Teisingai: trijų matmenų biorhodopsin molekulės struktūros modeliavimo rezultatas su 7 angstrų raiška. Vaizdai iš straipsnio R. Hendersonas, P. N. T. Unwin, 1975. Trimatis membranos modelis, gautas elektronine mikroskopija

Antra, Henderson turėjo galimybę keliauti į įvairius mokslo centrus ir išbandyti įvairius elektroninius mikroskopus. Kadangi per tuos metus nebuvo vienijimo, skirtingi mikroskopai turėjo privalumų ir trūkumų: skirtingi evakuacijos kameros laipsniai,skirtingas mėginio aušinimo laipsnis (tai sumažina elektronų apšvitos nuostolius), skirtingos elektronų sijų energijos, skirtingas jutiklių jautrumas. Todėl galimybė studijuoti tą patį objektą skirtinguose mikroskopuose leido pirmiausia pasirinkti "mažiausiai nepalankias" vaizdo gavimo sąlygas ir palaipsniui juos pagerinti. Taigi Henderson sukaupė duomenis ir sukūrė daugiau tikslių bakterijų tuberkuliozės struktūros. 1990 m. Jis paskelbė straipsnį, kuriame šio baltymo modelis buvo pateiktas su atomine spinduliuote (R. Hendersonas ir kt., 1990).

Pav. 4 Bakterihorodopsino modelis, gautas naudojant perdavimo elektroninę mikroskopiją – naudojant šį junginį kaip pavyzdį, Richardas Hendersonas parodė galimybę naudoti metodą, kad gautų vaizdus su biologiniais objektais, turinčiais atominę sklaidą. Trislės skirtingų spalvų linijos – cheminės jungtys tarp bakteriohorodopinso atomų, balti akių paviršiai parodyti elektronų tankio ribas aplink atomus ir atomines grupes. Paveikslas iš R. Hendersono ir kt., 1990. Bakterihorodopsino struktūros modelis, pagrįstas didelės raiškos elektronine kriomikroskopija

Šio novatoriško tyrimo metu Hendersonas parodė, kad krioelectron microscopy gali sukurti vaizdus su rezoliucija,kuris yra ne blogesnis nei rentgeno analizės metodas – tuo metu, kai tai buvo proveržis. Tačiau šis rezultatas iš esmės panaudojo faktą, kad bakterihorodopsinas reguliariai yra ląstelių membranoje, ir nebuvo aišku, ar būtų galima pasiekti tokią rezoliuciją kitoms "nereguliariosioms" molekulėms.

Nesėkmių signalų apdorojimo iš atsitiktinai išdėstytų biologiškai aktyvių molekulių problema buvo išspręsta dar vieno 2017 m. Nobelio premijos laureato Joachimo Frank. Jo pagrindinis indėlis į krioelektroninę mikroskopiją yra algoritmų, skirtų dvifazių vaizdų, gautų naudojant krioelectron microscopy, analizės algoritmų kūrimui, kurie leidžia mums sukurti aukštos kokybės trimačius modelius. Panašūs algoritmai jau buvo sukurti kitiems mikroskopijos metodams. Frank optimizavo ir daugeliu atžvilgių ištobulino matematinės analizės metodus, kurie leidžia atskirti naudingą informaciją, gautą elektroninės mikroskopijos metu, nuo signalų, kuriuos sukelia triukšmas. Dėl tam tikrų priežasčių dėl tikslių elektroninių prietaisų kyla triukšmas: atsitiktiniai srovės ir įtampos svyravimai gali būti susiję su netolygaus elektronų išmetimu elektrovacuum blokuose,nelygios formavimas ir rekombinacija krūvininkų (laidumo elektronų ir skylių) puslaidininkiniuose vienetų, šiluminis judesio iš nešiklius laidininkų (šiluminis triukšmas) arba išorės trukdžių (nepaisant to, kad visi paprastai gerai izoliuotas).

Pav. 5 Krioelectron microscopy signalų skaičiavimo metodai, kuriuos pasiūlė J. Frank. Schema iš svetainės nobelprize.org

Ši užduotis taip pat yra sudėtinga. Jei objektai, net jei jie yra tokie patys arba maždaug tie patys, kaip ir tokie tyrimai, yra sutrikę, jie duoda šiek tiek skirtingus struktūros signalus, kurie gali suplakti vienas kitą. Be to, tokio blur – triukšmo ar algoritmo klaidų priežastis – nėra lengva nustatyti. Pavyzdžiui, duomenų apdorojimo principas parodytas fig. 5: kelis tiriami molekulė plokštuminiai vaizdai išvalytas nuo triukšmo ir yra būdinga "kampas", tada iš vaizdų konstrukciją panašių kampų aukštesnės kokybės profilio, ir galiausiai trimatis modelis yra pastatytas iš šių profilius.

1981 m. Frank apibendrino matematinius modelius pirmojoje kompiuterinės programos SPIDER versijoje (elektronų mikroskopijos ir susijusių sričių vaizdo duomenų apdorojimo sistema, pirmoji publikacija: J.Frank ir kt., 1981. Spider – modulinė elektroninių vaizdo apdorojimo programinė įranga). Šis programinės įrangos paketas egzistuoja ir yra atnaujinamas iki šiol, be to, šios programos gali laisvai platinti, o tai neabejotinai palengvina mokslininkų darbą visame pasaulyje. Frankas naudojo savo algoritmus, kad gautų vaizdus apie ribosomos paviršių – susidedantį iš RNR ir susijusių ląstelių organoidinių baltymų, kurie naudojami baltymų biosintezei iš aminorūgščių remiantis genetine informacija.

Pav. 6 J. Dubcecherio siūlomas krioelektroninės mikroskopijos mėginių ruošimo metodas. Schema iš svetainės nobelprize.org

Prefiksas "Cryo" pasirodė elektroninėje mikroskopijoje, nes trečiasis laureatas Jacques Dubočė. Jis sukūrė vandeninių tirpalų greito aušinimo metodą su mėginiais (J. Dubochet, A. W. McDowall, 1981; vitrifikavimas vandens elektroninei mikroskopijai). Be to, vanduo turi užšalti taip greitai, kad molekulės neturėjo laiko susitvarkyti su kristalo grotelėmis, užšaldant, kaip buvo (žr. Amorfinį ledą). Tai pasiekiama greitai panardinant tirpalo ploną plėvelę su mėginiu talpykloje su skystu etanu, atvėsinta iki -160 ° C (6 pav.). Teisingas užšalimo būdas gali būti vadinamas viso metodo sėkmės pagrindu, nes užsakytieji ledo kristalai gali sukelti elektronų difrakciją, iškreipiant informaciją apie tiriamas molekules.Dėl to, kad didelės molekulinės masės baltymų ir nukleino rūgščių, šios molekulės yra lėtas, todėl jie neturi laiko tuo trumpąją užšalimo arba pakeisti savo poziciją, arba keisti formą. Tai reiškia, kad biologiškai aktyvių molekulių struktūra greito užšalimo būdu šiuo būdu nesikeičia. ją naudojant, Dyuboshe pirmą kartą taikomas Cryo-elektroninės mikroskopijos ištirti virusų struktūra (pav. 7 cm dydžio. M. Adrian et al., 1984 Cryo-elektronų mikroskopija virusus).

Pav. 7 Kairėje: bakteriofago T4 vaizdas, gautas G. Duboso grupės. Jūs galite visiškai atskirti keletą virusinių dalelių. Teisingai: trimatis šio viruso modelis. Vaizdas iš straipsnio M. Adrian ir kt., 1984. Krio-elektronų mikroskopija virusų ir moksliniai vaizdai.

1990-aisiais ir 2000-aisiais krioelektroninė mikroskopija pamažu vystėsi ir tobulėjo, sukūrus skaičiavimo galią ir tikslumą prietaisuose. Tačiau tikras krioelektroninės mikroskopijos žydėjimas prasidės 2012 m. Tai yra susijusi su tiesioginiais CMOS elektroniniais detektoriais, kurie gali tiesiogiai aptikti elektronus, kurie praeina pro pavyzdį. Tai leido mums supaprastinti elektroninių mikroskopų konstrukciją, pašalinti sudėtingas fokusavimo ir signalo konversijos sistemas ir sumažinti mazgų, dėl kurių atsiranda atsitiktinis triukšmas, skaičių.Kaip rezultatas, krioelectron microscopy metodo skiriamoji geba padidėjo iki 2-3 angstromų (8 pav.).

Pav. 8 Pažanga, padaryta gerinant krioelektroninės mikroskopijos per pastaruosius keletą metų sprendimą dėl fermento beta-galaktozidazės pavyzdžio. Nuotrauka iš "vox.com"

Taigi, 2017 m, beveik šešis dešimtmečius po kristalografinėje struktūra hemoglobino nustatymui Max Perutz (Max Perutz ir John Cowdery Kendrew "studijoms nuo kamuolinių baltymų struktūros" laimėjo Nobelio premiją 1962 chemijos), Cryo-elektronų mikroskopija tapo įmanoma ištirti vieną molekulę baltymo, tai nebėra kristaluose ir tirpale (9 pav.).

Pav. 9 Viršuje: hemoglobino kristalų rentgeno spindulių vaizdas Straipsnyje J.D. Bernal, I. Fankuchen & maks Perutz, 1938. rentgeno spindulių tyrinėjimas chimotripsino ir HÆmoglobin (kairėje) ir rekonstruotas hemoglobino molekulės 3D struktūros rentgenogramoje (dešinėje). Žemiau: skirtingos hemoglobino molekulės, gautos krioelectron microscope (kairėje) ir trimatis šios molekulės modelis (dešinėje), vaizdai iš M. Khoshouei ir kt., 2017 m. Krio-EM struktūros hemoglobinas esant 3.2 E, nustatytas naudojant Volta fazinę plokštelę. Viršuje dešinėje: hemoglobino molekulės modelis iš rcsb.org

Tiksli informacija apie biologiškai aktyvių junginių struktūrąjų sąveikos tarpusavio ypatumai ir jų dalyvavimas biocheminiuose procesuose yra svarbūs tiek esminiais terminais, tiek sprendžiant praktines problemas, pavyzdžiui, kuriant naujus vaistus ir kuriant naujus ligų gydymo metodus.

Vienas praktinis krioelektroninės mikroskopijos taikymo pavyzdys šioje srityje gali būti laikomas Zikos viruso tyrimu (10 pav.). 2016 m. Brazilijos epidemijos protrūkio metu mokslininkai praleido kelis mėnesius gauti informacijos apie viruso struktūrą krioelektronine mikroskopija (D. Sirohi ir kt., 2016 m. Zika viruso 3,8 Å raiškos krio-EM struktūra).

Pav. 10 Zikos viruso struktūra, nustatyta naudojant krioelectron microscopy. Figūra iš virology.ws

Kitas pavyzdys yra tai, kad šiais metais krioelectron microscopy leido gauti didžiausio šeimos herpes virusų – žmogaus citomegaloviruso (X. Yu ir kt., 2017) – kappido struktūrą. Tyrimo rezultatai tapo pagrindu ieškoti galimų kapiliarų sekų, susijusių su virusais, kurie gali tapti molekuliniais tikslais antivirusiniams vaistams.

Arkadijus Kuramshinas


Like this post? Please share to your friends:
Parašykite komentarą

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: