Katalitinė RNR: vaistas nuo prebiologinio gyvenimo

Katalitinė RNR: vaistas nuo prebiologinio gyvenimo

Sidnėjus Altmanas
"Science First Hand" № 3/4 (57/58), 2014

Pagrindinė RNR pasaulio koncepcijos idėja, kuri pasirodė devintajame dešimtmetyje, yra paprastas: ankstyvosiose prebiologinės evoliucijos stadijose objektai, galintys dauginti ir varžytis dėl ribotų išteklių, buvo atskiri RNR molekulės, o vėliau baltymai ir DNR tapo tik papildymu, nors ir labai svarbus bendram genetinės informacijos srautui. Ši koncepcija, pradžioje besiribojanti su moksline fikcija, dabar tvirtai įsitvirtino pasaulio biologijoje.

Svarbiausias atradimas buvo Ralos katalizinių savybių atradimas Yale universiteto (JAV) profesoriaus S. Altmano laboratorijoje tyrime fermento RNAse P (dabar šie fermentų katalizatoriai vadinami ribozimais). Katalizinių RNR savybių atradimui Altman kartu su T. Čechu gavo Nobelio premiją chemijoje (1989 m.). RNase P prigimties paaiškinimas tapo pradiniu tašku, norint paversti jį nepageidaujamos RNR sunaikinimo priemone, pavyzdžiui, bakterijomis. Tokia gydymo strategija žada žmoniją lenktynėse, kurios vis dar buvo laikomos prarastomis, pergalę tarp naujų vaistų ir atsparumo jiems, kurioms bakterijoms įsigyti.

Apie autorių

Sidnėjus Altmanas – Sterlingas, Molekulinės ir raumeninės biologijos ir biologijos profesorius, Yale universitetas, Jeilio universiteto (JAV) chemijos profesorius, Rusijos mokslų biomedicininės chemijos laboratorijos instituto chemijos biologijos ir fundamentinės medicinos instituto SIBIRO (Novosibirskas) vadovas. Nobelio premijos laureatas chemijoje (1989), gautas kartu su T. Čechu "RNR katalizinių savybių atradimui".

Šiandien mes galime stebėti reliktus, išgyvenusius nuo pasibaisėjimų iki biologinės evoliucijos laikų – RNR molekulių, kurie užsiima ne įprastine genetinės informacijos perdavimu iš DNR į baltymą, o visiškai kitokiais dalykais, kurie yra būtini organizmo gyvybinei veiklai. Labai daug reguliuojančių, katalizinių, adapterių ir struktūrinių RNR egzistavimas rodo, kaip anksčiau galėjo būti anksčiau, tačiau iki biologinio gyvenimo.

Vienas iš šių relikvijų per pastaruosius keturiasdešimt metų kilo iš egzotinio biocheminio smalsumo iki galimo "visų medikamentų" panacėjos. Ši istorija parodo, kaip itin akivaizdu, kad išskirtinai fundamentaliose studijose gali greitai atsirasti nauja idėja,galintis paversti svarbiausią žmogaus veiklos sritį – mediciną. Mūsų atveju šis objektas yra RNAse p – fermentas, kuris dalyvauja transkripcijos po transkripcijos būdu (t. y., po DNR skaitymo) RNR modifikacijų.

Apie RNR "manekliams"

Remiantis pagrindine molekulinės biologijos dogma, paveldimos informacijos "tekstas", parašytas RNR nukleotidų raidėmis (pvz., … AAAUUGAGAUC …), transliuojamas į kitą tekstą, parašytą aminorūgščių raidėmis. Vertimas, t. Y., Baltymų sintezė koduojančioje RNR matricoje, atliekamas ribosomos – specialios ląstelinės makromolekulinės baltymų gamybos mašinos. Ribosomos veikimas neįmanomas be dviejų dar daugiau RNR klasių, kurios jau nekoduojamos: ribosomas RNR (rRNR) ir transportavimo RNR (tRNR).

E. coli ribosomos (bakterijos Escherichia coli), molekulinės biologijos darbo raumenyje, yra trijų skirtingų rRNR molekulių, ir mes turime keturis. Taigi, kad gyvenimas biologams neatrodytų medus, kiekviena iš šių rRNR E. coli koduojami septyni skirtingi genai, kurie yra labai panašūs vienas į kitą; žmonių padėtis yra apie tą patį.

Bet jei pažvelgsite į tRNą,čia vis dar sudėtingiau: E. coli turi 86 genus, koduojančius tRNR 20 standartinių aminorūgščių, bet žmogus su savo 497 branduoliu ir 22 mitochondrijų transportavimo RN palieka toli nuo jo. Žinoma, toks skaičius skirtingų tRNR yra daugiau nei pakankamai, kad būtų galima koduoti 20 aminorūgščių arba net 61 tripleto antikodonų. Yra žinoma, kad kai kurie tRNR molekulių, turinčių tą patį tripletą, skirtumai turi funkcinę reikšmę, o ląstelė, priklausomai nuo aplinkybių, naudoja tam tikrą rūšį tRNR.

TRNR struktūra dažnai vaizduojama kaip "dobilų lapelis". Iš tiesų stebina, kad tokia gana trumpoji grandinė (daugiausia tRNR yra nuo 75 iki 95 nukleotidų ilgio) gali sudėti į struktūrą, kurioje yra keturios šakos, "stiebas" ir trys kilpos. Vienoje kilpa yra antikodonas – trijų nukleotidų regionas, kuris atpažįsta codoną, koduojantį konkrečią aminorūgštį messenger RNR.

Be pagrindinių kilpų, tRNR taip pat yra vadinamoji kintamoji linija, kurios ilgis yra pagrindinė savybė, pagal kurią tRNR yra padalyta į dvi grupes: I klasės tRNR yra trumpas (3-5 nukleotidai), o II klasės jis gali būti ilgesnis nei pagrindinės kilpos.Akceptoriaus kotelis yra trumpa viengubos srities 3'-galas (dažniausiai 4 ilgio nukleotidai), baigiasi sekos … CCA, kuris gali kovalentiškai pritvirtinti amino rūgštį, kad sudarytų aminoacil-tRNą, pagrindinį baltymų sintezės pastato bloką.

Tačiau toks pažįstamas paveikslas su dobilų lapais yra tik diagrama: tikroji tRNR erdvinė struktūra yra visiškai kitokia ir greičiausiai primena raidę "G", kurios dydis yra ~ 6 × 6 nm, kurioje antikodonas ir akceptoriaus kamieno 3'-galas yra kiek įmanoma didesni. .

"Neįrašytas" ribozmas

Paprastai tRNR sintezuojasi kaip ilgoji pirmtako molekulė (pavyzdžiui, bakterijose keli greta esantys genai paprastai "skaitomi" kartu viena RNR molekule). Todėl, brandinant, tRNR ištraukiama iš ilgesnių stenogramų. Šį procesą vykdo fermentas RNase E, bet tuo pat metu tRNR pirmtako 5'- ir 3'-galuose lieka keletas papildomų nukleotidų, todėl jų pašalinimui reikalingas kitų specifinių nukleozių poveikis.

Vienas iš šių fermentų, RNase P, skirtas nukleotidų pašalinimui iš tRNR pirmtako 5 'galo.Ši nuclease tapo pagrindine darbo vieta mano laboratorijoje nuo 1970-ųjų pradžios, kai atradome, kad tRNR sintezuoja iš jo pirmtako RNR. Bet, žinoma, mūsų svarbiausias ir netikėtas atradimas dėl šio nuclease, paskelbtas 1983 m. Žurnale Ląstelė, buvo nustatyti jo sudedamosios RNR katalitines savybes. Kitaip tariant, fermentas nebuvo baltymas, o RNR – dabar tokie katalizatoriai vadinami ribozimetu.

Fermentas RNase P visuose gyvuose organizmuose randamas komplekse su bent vienu baltymu. Be katalizinės RNR, bakterijų fermentas turi tik vieną baltymą (RnpA). Autorius: (Walker Engelke, 2008)

Tiesą sakant, RNazė RNase P niekada neveikia savarankiškai. Jis gali inaktyvinti reakciją in vitro, bet visuose gyvuose organizmuose jis derinamas su bent vienu baltymu ir aukštesniuose organizmuose (eukariotesa) paskutinis numeris pasiekia dešimt. Nors RNR, net pašalindamas baltymus, išlaiko dalinį katalizinį aktyvumą, jis negali veikti ląstelėse, visiškai neturinčiose vieno iš RNazės P proteino komponentų. Tačiau logiškai tariant, kad visi šiandien žinomi RNazai P yra gauti iš pirmtako, kuriame yra tik RNR,kai šis "protėvis" egzistavo: ankstyviausiais "RNR pasaulio" evoliuciniais laikais ar vėliau, kai baltymų sintezės vamzdynas pradėjo įgyti šiuolaikišką išvaizdą.

Mūsų tyrimai apie RNazės P veikimo mechanizmą leido mums nustatyti minimalius reikalavimus jo substratui. Ką turėtų atrodyti RNR molekulė, kad ją galėtų atpažinti ir suskaidyti šis ribozmas?

Nuostabiai, dobilų lapų struktūra apskritai nereikalinga. RNase P veiksmingai sulaužo bet kokią RNR, kuri primena tRNR stiebo, t. Y. Ji yra dalinai dvigubos grandinės su laisvuoju vieno smegenų 3'-galu … RCCA (kur R yra adenino arba guanino likutis). RNase P suskaido šiuos substratus iš 5'-galo taške, kur baigiasi dvipusioji DNR ir prasideda viengubas "uodegas". Net jei mes priimsime kaip tikslinę RNR su bet kuria seka, o kita – papildydami ją – suteiksime RCCA uodegą (taip vadinamą išorinė gido seka), tada tikslas vis tiek bus padalytas.

Fermentas RNase P dalyvauja nukleotidų pašalinime iš tRNR pirmtako 5'-galo, esančio šalia 3'-"uodegos". Tačiau pasirodė, kad jo darbas nereikalauja "dobilų lapo" struktūros, kurioje paprastai atstovaujama tRNR.RNase P veiksmingai sulaužo bet kokią RNR, kuri panaši į tRNR "kotelį", t. Y. Dalinai dvigubą, su laisvu vieno gyliu 3 galu. Fermentas suskaido šiuos substratus iš 5-ojo pusės toje vietoje, kurioje baigiasi dvivalentė DNR, ir prasideda viengubas uolelis

Tokio "neįskaitomumo" priežastys aiškiai išplaukia iš RNase P struktūros, kuri buvo dekoduojama rentgeno spindulių analize. Ribozyme substratus susieja daugiausia dėl to, kad jo struktūra atitinka pagrindo formą, o specialios papildomos ribos yra suformuotos tik 3'-galo dalyje, kur yra neatsiejama uodega. Be to, galima naudoti net chemiškai modifikuotą gido RNR, jei tik joje yra sekos, reikalingos atpažinti.

Archeoje – vienarūšės prokariotos, kurios kai kuriuose genuose ir metabolizmo keliuose yra arčiau eukariotų, nei bakterijoms, – RNazės formavimui P, jo RNR jungiasi prie 4-5 baltymų, kurių nė vienas nėra panašus į RnpA. Eukariotuose iki dešimties baltymų yra susietos su katalizine RNR, kai kurios iš jų yra homologinės archeologiniams baltymams, o kitos yra unikalios eukariotams. Autorius: (Walker Engelke, 2008)

Atsparus vaistams

RNazės substrato specifiškumo paaiškinimas buvo pradinis taškas tolesniems paieškoms. Kadangi mes galime suskaidyti beveik bet kurią RNR, naudojančią RNase P, kodėl gi ne paversti priemone sunaikinti nepageidaujamą RNR? Pavyzdžiui, jei mes galėtume įvesti išorinę nukreipiančią RNR į patogeninių bakterijų ląsteles, jų pačių RNazė P gali sunaikinti papildomą ląstelių RNR tikslą, kurio praradimas būtų mirtina bakterijai.

Ar tai būtina? Dėl plačiai paplitusio nekontroliuojamo antibiotikų vartojimo padidėjo vaistų atsparumas mikrobams. Viena iš pagrindinių jos išvaizdos priežasčių – bakterijos lengvai keičia genetinės medžiagos gabalus (plazmidės), kurie dažnai turi antibiotikų atsparumo genus. Taigi, jei tokia plazmidė atsiranda kai kurių bakterijų populiacijoje arba net mikrobų ekosistemoje, kurią sudaro skirtingos rūšys, tada labai greitai visi jos nariai tampa nešėjais, jei aplinkoje yra tinkamas antibiotikas. Visos kitos bakterijos ląstelės tiesiog išnyks.

Būtina paaiškinti, kad atsparumas vaistams gali išsivystyti ir dėl kitų priežasčių, susijusių su vaisto paskirto baltymo mutacija, per daug nukreiptų baltymų gamyba iš ląstelių, taip pat dėl ​​genų, atsakingų už vaisto pašalinimą iš organizmo, aktyvavimą. Apskritai, atsparumo vaistui ir su ja susijusi rizika yra milžiniška. Pavyzdžiui, šiandien visame pasaulyje pastebima daugelio vaistinių preparatų atsparių tuberkuliozės formų, nejautrių pirmosios eilės anti-TB antibiotikams (izoniazidui ir rifampicinui) ir sukelia 4% naujų atvejų ir 20% ligos recidyvų. Jei tuberkuliozės bakterijos taip pat atsparios chinolonų antibiotikams ir antros eilės vaistams – kanamicinui ir tt, tada jie sukelia ligą, kuri atspari ekstremaliems vaistams. Ir tokie atvejai pasaulyje yra dešimtys tūkstančių per metus. Pridėkite, kad Indijoje, Irane ir Italijoje jau yra tuberkuliozės atvejų, kurių bendrasis atsparumas vaistams yra, o iš esmės tai netinka šiuolaikiniams antibiotikams.

Situacija nepagerėja ir faktaskad naujo antibiotiko kūrimas kainuoja milijonus dolerių, o farmacijos kompanijos nepasileidžia, kad išleisti šiuos milijonus būtų sukurta nebrangių vaistų, skirtų siaurai vartotojų grupei. Pacientai, kurie, be abejo, būtų išleidę dešimtys tūkstančių dolerių už chemoterapijos kursą dėl vėžio, prailginantį gyvenimą keletą mėnesių, nenoriai moka šimtą dolerių už infekcijos gydymą.

Tiksli hitai

Realizuojant RNazės P išorinių orientacinių sekų terapinį potencialą, mes pradėjome ieškoti būdų, kaip juos efektyviai pristatyti į bakterijų ląsteles. Tuo tikslu gido sekos buvo susietos su specialiais peptidais (trumpi baltyminiai fragmentai), kurie gali sukelti skylę bakterijų ląstelių sienoje arba aktyviai transportuoti į ląstelę. Šiuo atveju gido seka atlieka tam tikrą "keleivio" vaidmenį.

Kitas svarbus sprendimas buvo vadovaujančiųjų sekų cheminių savybių pasirinkimas: mes naudojome ne įprastą RNR ar DNR, bet taip vadinamą morfolino oligonukleotidai, kurioje vietoj angliavandenių ribozės arba dezoksiribozės likučių yra heterociklinė morfolino grupė.Tokie konstruktai yra stabilesni ląstelėse ir sudaro griežtesnius kompleksus su RNR tikslais.

Kaip tikslą, mes panaudojome bakterinę mRNR, transkribuotą iš gyrA geno, kuris koduoja DNR girazės fermentą, reikalingą bakterijoms replikuoti. DNR girazės inaktyvacija yra mirtina bakterijų ląstelėms. Todėl girazė yra žinomas toks svarbių antibiotikų grupių tikslas kaip fluorhinolonai (pvz., Neseniai populiarus antibiotikų ciprofloksacinas) ir aminokumarinai.

GyrA genas yra toks konservatyvus, kad tapo įmanoma sukurti keleto patogenų bendrąją orientacinę seką. Mūsų laboratorijoje vadovaujančių sekų baktericidinės savybės buvo tiriamos kelioms bakterijų rūšims, kurios yra patys patogenai arba yra pavojingų bakterijų modeliai. Daugeliu atvejų, vartojant mūsų vaistą, išgyveno mažiau nei 1% bakterijų, nors reikia pripažinti, kad vaisto koncentracija yra gana didelė, lyginant su įprastų antibiotikų darbo koncentracijomis.

Įkvėpus pirmosios sėkmės, mes atkreipėme dėmesį į kitą ligą – maliariją. Vienas iš maliarijos sukėlėjų Plasmodium falciparum, reiškia ne bakterijas, o vienarūšius eukariotes. Tačiau šio parazito klinikinių izoliatų metu taip pat pastebimas atsparumas daugeliui antimalarinių vaistų. Kai mes sukūrėme orientacinę seką tiksliniam mRNR, koduojančio plazmodžio DNR girazę, ir paskleidė ją į užkrėstų raudonųjų kraujo kūnelių, parazitas nustojo augti. Tačiau tai atrodė puikiai, jei mes pristatėme nukreipimo seką, sukurtą bakterijų gyrA genu, t. Y. Šiuo atveju tikslinė mRNR buvo specialiai sunaikinta P. falciparum.

Daugelis nelaimingo likimo vaistų baigia karjerą tuo metu, kai, nepaisant perspektyvių preliminarių rezultatų, jie neveikia gyvo organizmo. Todėl kitame etape mes bandėme savo požiūrį situacijoje, kuri būtų artimesnė realybei – žaizdoms.

Žinoma, mokslo labui, tai buvo ne nukentėję žmonės, bet laboratorinės pelės, kurios buvo įšvirkštos į nugarą, ir dėl to atsiradusi žaizda sukėlė Staphylococcus aureus suspensiją, dažnį žmogaus odos infekcijų sukėlėją. Kitą dieną žaizda buvo padengta specialiu geliu,kuriame yra morfolino oligonukleotidas, nukreiptas į bakterinio geno gryno mRNR, anksčiau gerai pasiteisino, kad jis yra jautrus ir atsparus antibiotikų kamienams; kontrolė buvo arba nespecifinė seka, arba įprastas fiziologinis tirpalas. Pasirodo, kad žaizdos gerokai išgydavo pelėms, gydomoms aktyviu morfolino oligonukleotidu, lyginant su kontrolinėmis grupėmis. Remiantis mikroskopijos duomenimis, gydymas pagerino epitelio ir brandaus kolageno sluoksnio atsinaujinimą. Be to, tokių pelių žaizdose bakterijų skaičius taip pat buvo daug mažesnis. Taigi buvo atliktas griežtas žinduolių organizmo aktyvumo tyrimas – bent jau pelėms.

Remiantis RNase P ribosizmo veikimu pagrįsta gydymo strategija žmonija žada žmonėms laimėti lenktynes, kurios iki šiol buvo laikomos prarastomis: tarp naujų vaistų ir atsparumo jiems, kurioms bakterijoms įsigyti. Galų gale, kai naujo narkotiko sukūrimas kainuoja 100 milijonų JAV dolerių, o nuo idėjos iki vaistinės lentynos užtrunka 10 metų, o bakterijos tampa visiškai atsparios vienerius ar dvejus metus, tai nėra pagrindo nuversti apie nugalėtoją.

Narkotikai, kurie gali konkrečiai suskaidyti bakterijų RNR, gali drastiškai pakeisti šią situaciją. Patvirtinus šios junginių grupės saugumą ir veiksmingumą, pavyzdžiui, morfolino oligonukleotidai, prijungti prie specifinio peptido, galinčio patekti į ląstelę, gido seką galima laisvai keisti, nukreipdama jį į įvairius gyvybiškai svarbius patogenų genus. Arba net sujunkite tikslus, todėl atsparumo vaistams atsiradimas beveik neįmanomas. Galiausiai ir farmakologijai tai yra išimtis, o ne taisyklė – tos pačios rūšies vaistai gali veikti bakterijas, protozoanus ir grybelius, galbūt net virusus ir tam tikrų rūšių vėžines ląsteles. Norėdami tai padaryti, tiesiog raskite būdą pristatyti vaistą tinkamoje vietoje.

Kodėl gydytojai vis dar remiasi ampicilinu, chlorokvinu ir kitais prieš daugelį metų esančiais arsenalais infekcijų gydymui? Atsakymas daugiausia yra ekonomikos plane. Morfolino (ir bet kurios kitos) nukreipimo sekos iš tiesų yra brangesnės nei tradiciniai antibiotikai, kurie gaminami masiniu būdu,ir farmacijos įmonės bijo, kad pacientai ir gydytojai norės toliau naudoti senus vaistus. Tačiau kainų skirtumas nėra toks didelis: viena dozė gali kainuoti 2-3 JAV dolerius daugiau nei įprasto antibiotiko dozė. Terapija, pagrįsta RNase P taikinio sekomis, yra efektyvi ir turi mažiau šalutinių reiškinių. Mūsų nuomone, atėjo laikas suvienyti mokslininkų, gydytojų, farmacijos įmonių ir valstybės pastangas ir investuoti į naujas technologijas, kurios atneš didžiulę naudą visiems.

Autorius ačiū prof. D. B. n D. Жаркова (ИКБФМ SU anksčiau, Novosibirskas), skirta parengti leidinį, paremtą paskaita, autoriaus pateiktas 2014 m. Gegužės mėn. Novosibirske. Šis darbas buvo paremtas Rusijos Federacijos Vyriausybės dotacija (2013 m.).

Literatūra
1. Vlasovas V. V., Vorobjevas P. E. Pasaulis RNR: Vakar ir šiandien // Mokslas pirmoji. 2012. № 3 (45). 40-49 psl.
2. Gorman K., Fayn Maron D. Revoliucija RNR pasaulyje // Mokslo pasaulyje. 2014. Nr. 6. P. 70-77.
3. Grigorovich S. Iš pradžių buvo RNR? Pirmojo gyvenimo molekulės paieškoje // Mokslas ir gyvenimas. 2004. № 2.


Like this post? Please share to your friends:
Parašykite komentarą

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: