GMO augalai: kaip tai daroma

GMO augalai

Vladimiras Viktorovich Chubas,
Biologinių mokslų daktaras, biologinių fakultetų augalų fiziologijos katedra, Maskvos valstybinis universitetas jiems. M. V. Ломоносова
"Potencialas: chemija, biologija, medicina" № 11, 12, 2011; № 1, 2 2012

  • GMO augalai: kaip tai daroma
  • GMO augalai: praktinis taikymas
  • GMO augalai: projektai perspektyvoje

GMO augalai: kaip tai daroma

"Potencialas. Chemija, biologija, medicina" № 11, 2011

Tikriausiai kiekvienas iš jūsų girdėjo apie baisią neįveikiamą ligą – vėžį, kuris gali paveikti daugelį žmonių ir gyvūnų organų. Kyla klausimas: ar augalai kenčia nuo vėžio?

Ankstesniame straipsnyje jūs sužinojote apie kūną, neorganizuotą didėjančią augalų ląstelių masę, kuri dažnai įvyksta natūraliomis sąlygomis žalos vietose ("Potencialas", Nr. 10, p. 23).

Ar augalai gauna vėžį?

Kaliaus augimas primena auglių augimą gyvūnams. Tačiau, laimei, augalams jų ląstelių dalijimas visada priklauso nuo dviejų hormonų: auksinų ir citokininų. Norėdami sustabdyti kaleidų augimą, pakanka sumažinti bent vieno iš jų (pats kalių ląstelės paprastai negali formuoti šių medžiagų).Tačiau, kaip jūs prisimenate, daugelis kenkėjų ir augalų patogenų sintezuoja arba oksinus, arba citokininus (retais atvejais – abu), siekiant kontroliuoti augalų ląstelių augimą. Tuomet formuojasi "raganos šluotos", garsai ir kiti skausmingi augalai kūne. Bet tai tik vienas ar kitas būdas sunaikinti patogeną, skausmingas augimas tuoj pat sustos. Taigi nei kallus, nei goliai nėra piktybiniai vėžiai.

Tačiau augalai gauna vėžį. Tai sukelia bakterijos iš Rhizobia šeimos (Rhizobiacae), priklausantys Agrobacterium genties (Agrobacterium) Infekcijos vietoje susidaro neorganizuota skilimo ląstelių masė, panaši į kalį (1 pav.). Jei Agrobacterium žudoma antibiotikais, auglio augimas tęsis. Pasirodo piktybinis auglys, kurio augimas negali kontroliuoti.

Pav. 1. Karūninis gelis – piktybinis auglys, kurį sukelia agrobakterijos (Agrobacterium tumefaciens) alyvoje. Vaizdas: "Potencialas. Chemija. Biologija.

Analizuojant naviko hormonų kiekį, paaiškėja, kad padidėja auksinų ir citokininų kiekis.Kiekviena naviko ląstelė gali savarankiškai gaminti šiuos hormonus ir nebeturi priklausomybės nuo likusio augalo kūno.

Agrobakteriai – natūralūs "genetiniai inžinieriai"

Agrobakterijos infekuoja daugiausia dvikelius augalus, tarp kurių labiausiai matomi augliai medžių ir krūmų. Agrobacterium sukelia vynuogių šaknų vėžį (patogeną – A. vitis, agrobacterium "vynuogių"), aviečių šaknis (A. rubi, agrobacterium "avieta"), karūnėlių tulžies liga daugelyje šeimininkų (A. tumefaciens, agrobacterium "auglio formavimas"). Neįprasta liga, pasireiškianti šaknų šaknų masyvo formavimu, tankiai padengtu šaknų plaukais – "rausvos" ar "brolinės" šaknies liga – taip pat sukelia agrobakterijos (A. rhizogenesas, agrobacterium "root"). Tarp agrobakterijų taip pat yra palyginti "taikių" (nepatipinių) rūšių – A. radiobakteris (Agrobacterium "šaknis"), kuris gyvena plonu augalinių šaknų plotu sluoksniu. A. radiobakteris maitina šaknų sekretus, tačiau nekenkia patiems augalams. Kas sukėlė daugelio rūšių agrobakterijų infekcines savybes?

Bakterijų genetinė medžiaga susideda iš nukleozė (didelė apskrita DNR molekulė, kurioje saugoma "pagrindinė" genetinė informacija), ir plazmidė (mažesnės apskritimo DNR molekulės su mažesniu informacijos kiekiu). Agrobakterijų savybė užkrėsti vienos ar kitos augalo rūšis yra "suprogramuota" konkrečiai plazmidėse. Priklausomai nuo ligos tipo, šios plazmidės vadinamos Ti-plazmidėmis. navikas sukelia – sukelia navikus) ir Ri-plazmidės (iš anglų kalbos. šaknys sukelia – sukelia (šaknius) šaknis). Kai plazmidės prarandamos, agrobakterijos praranda gebėjimą sukelti atitinkamas ligas.

Plazmidės turi keletą įdomių ir praktiškai svarbių savybių. Pirma, toje pačioje ląstelėje Agrobacterium negali patenkinti ne tik Ti ir Ri plasmidų, bet ir dviejų skirtingų Ti plazmidžių! Kažkaip pirmoji plazmidė "nusistovėjusi" bakterijoje neleidžia skverbtis ir daugintis kitų panašių plazmidžių.

Antra, plazmidės gali būti perduodamos iš vienos bakterijos ląstelės į kitą. Paradoksalu tai, kad dirvožemyje tik 1-5% laisvai gyvenančių agrobakterijų ląstelių yra "ginkluoti" Ti- arba Ri-plazmidėmis. Tačiau, kai prasideda infekcija, plazmidės aktyviai plečiasi ir perduodamos iš bakterijų į bakterijas.

Trečia, Ti- ir Ri-plazmidai (palyginti su kitomis bakterijų plazmidėmis) turi didelius dydžius: apie 200-300 tūkstančių bazinių porų. Tai neleidžia naudoti standartinių metodų atskirti šių plasmidų DNR nuo nukleozės DNR, dėl to susidaro tam tikri sunkumai molekulių biologų darbe su plazmidėmis.

Kokie genai turi Ti-plazmides? Augalų infekcijai svarbiausias yra Vir-regionas. virulentiškumas – gebėjimas užkrėsti [augalus], patogeniškumas), kuriame koduojami gana daug genų. Nuolat dirba tik du genai: VirA ir VirG. VirA baltymas yra tam tikros fenolio medžiagos receptorius – acetosyringone. Acetosyringone išsiskiria, kai yra pažeistos augalinės ląstelės. VirA baltymas reaguoja į acetosyringoną ir perduoda signalą į VirG baltymą, kuris aktyvuoja visus kitus Vir-regiono genus. Kaip rezultatas: 1) agrobakterijų ląstelės plaukia į sužalojimo vietą (daugiausia dėmesio skiriant acetosyringono koncentracijos didinimui); 2) Ti plazmidė pradeda daugintis ir perduodama kitoms tos pačios rūšies bakterijoms; 3) pasirodo kiti Vir-regiono genų baltyminiai produktai (2 pav.).

Pav. 2 Kai kurių baltymų funkcijos iš Vir-regiono. Vaizdas: "Potencialas. Chemija. Biologija.Medicina "

VirD1 baltymas kartu su VirD2 baltymu aptinkame tam tikrus regionus, susidedančius iš 25 bazinių porų Ti plazmidėje, ir juos nukirpkite, nukreipdamas kovalentinį ryšį iš DNR galo į VirD2 baltymą. Turiu Agrobacterium tumefaciens Yra du tokie sklypai: jie apriboja vadinamąjį T-regioną. perduotas – nešiojamas). Viena iš DNR grandžių yra atskirta ir paliekama; Taigi Ti-plazmidėje atsiranda spraga. Speciali DNR atkūrimo sistema sukuria atotrūkį su nauju DNR grandine, o T-regioną galima iš naujo iškirpti iš tos pačios Ti-plazmidės, paprastai Ti-plazmidė yra konservuota.

Vienąsluoksnė T-DNR, susieta su VirD2 baltymu, toliau "išbarstoma" naudojant VirE2 baltymą, todėl bakterijų ląstelių fermentų sistemos neleidžia sunaikinti viengubos T-DNR.

DNR pernešimo iš vienos ląstelės į kitą aparatas susidaro Agrobacterium ląstelių paviršiuje, naudojant įvairius VirB baltymus. VirB baltymai yra atsakingi už VirD2 komplekso judėjimą iš viengubos DNR iš Agrobacterium ląstelės į augalo ląstelę. VirE2 baltymai taip pat perkelia į ląstelę-šeimininką.

Be to, viengubos T-DNR kompleksas su VirD2 ir VirE2 baltymu įsiskverbia į augalo ląstelės branduolį. VirD2 baltymas "nukiria" ląstelės-šeimininko DNR ir įterpia T-DNR iš Ti plazmidės.Taigi atsiranda svetimos DNR įterpimo į augalo ląstelių DNR procesas. Po to augalo ląstelę galima laikyti genetiškai modifikuotu. Agrobakterijos evoliucijos procese "sukūrė" genetiškai modifikuotų augalų ląstelių gavimo mechanizmą, tai yra, jie tapo natūraliais "genų inžinieriais".

Kas yra T zonoje

Genai, esantys T regione Agrobacterium ląstelėje, neveikia, nes jie turi tik eukariotinių promotorių. Du abu genai yra atsakingi už auksino biosintezę: iaaH ir iaaM. Kitas genas – iptZ – koduoja pagrindinį fermentą izopenteniladenino (citokininų formos) sintezei. Taigi, vieną kartą augalo genome T-DNR sukelia auksinų ir citokininų sintezę (3 pav.). Tuo pačiu metu priimančiosios augalo ląstelės pradeda suskaidyti neorganizuotai, formuojant naviką.

Pav. 3 Įvedus T-regioną priimančiosios augalo ląstelėje, prasideda nekontroliuojama oksinų, citokininų ir opinų sintezė. Vaizdas: "Potencialas. Chemija. Biologija.

Tačiau, norint, kad augalų ląstelių dalijimasis būtų naudingas Agrobakterijoms, būtina, kad jie sintezuotų kažką naudingo Agrobacterium.Iš tiesų, T-regione yra medžiagų, susidarančių iš aminorūgščių ir keto junginių, biosintezės genai. Šios medžiagos vadinamos opinomis. Nei pačios augalai, nei kiti augaluose gyvenantys organizmai negali suskaidyti nuomonių. Ir tik Agrobakterijos gali "virškinti" opines, kurių sintezė jie sukėlė.

Yra daug opų, ir kiekviena Ti-plazmidė suteikia savo nuomonės (nopaline, agrocinopinas, vitopinas, kurkuminas ir tt) sintezę. Pačioje Ti-plazmidėje (bet ne T regione!) Yra genų, atsakingų už atitinkamo opino "virškinimą". Tai paaiškina, kodėl viena Ti-plazmidė, užfiksuojanti Agrobacterium ląstelę, neleidžia į ją atsirasti kitos Ti-plazmidės, kuri yra atsakinga už kito požiūrio sintezę ir metabolizmą.

Įvedus DNR iš T regiono, naviko ląstelės intensyviai padalija ir gamina tiksliai opinį, kuris gali "virškinti" agrobakteriją, kuri sukėlė infekciją. Jei dirvožemyje gyvena du skirtingi agrobakterijų tipai, tada infekcijos metu pirmoji bakterija kažkaip neleidžia kitai, kuri įtakoja skirtingą nuomonę.

Remiantis šiuo biologiniu kovos su agrobakteriniu vėžiu metodu. Kaip žinote, nėra patogeninių agrobakterijų.Jie taip pat "neleidžia" kitų rūšių agrobakterijų augalo šaknų sistemai, per kurią atsiranda pažeidimas. Jei augalas iš anksto apdorotas tam tikrais štamais A. radiobakteristada augalas nebus suserga ne su karūnėlių tulžies, šaknies vėžiu, nei nuo barboto šaknų ligos.

Keista, kad kai kuriose plazmidžių kompozicijoje esančiose agrobakterijose nėra vieno, bet dviejų ar net trijų T regionų, kurių kiekvienas yra "įrėmintas" su 25 nukleotidų sekomis. Tais atvejais, kai A. rhizogenesas šios svetainės vadinamos TL ir tR-regionai ir A. rubi ten yra tA, T.B ir tC atitinkamai. Labiausiai stebina barzdotas (rausvas) šaknis. TR– regione yra tų pačių genų, kaip ir kitos agrobakterijos. Jie yra atsakingi už auksinų, citokininų ir opinių junginių sintezę. TL– regione yra genų, atsakingų už neaktyvių auksinų formų aktyvavimą. Pasirodo, kad sėkmingai infekcijai pakanka tik T.L-regionas! Tuomet naviko ląstelės suaktyvina "atsargines" pačios augalo auksinų formas, o tai sukelia rhizogenizmą, t. Y. Daugelio atsitiktinių šaknų formavimąsi naviko vietoje.

Taigi, dėl T-DN perdavimo iš Ti-plazmidės į šeimininko augalo ląstelę atsiranda nekontroliuojamas hormonų (auksinų ir citokininų) susidarymas,kuris veda prie piktybinių ląstelių augimo ir tolesnio sintezės azoto turinčių medžiagų – ops. Vis daugiau ir daugiau aminorūgščių patenka į auglio vietą, tačiau jie yra "išvežami iš apyvartos" augalui, nes jie yra paverčiami į naujas opines dalis, kurios yra atitinkamo agrobakterijų štamo mitybos šaltinis. Augalų ląstelės negali atsikratyti svetimos DNR. Ląstelių augimas ir opin s sintezė tęsiasi net tada, kai agrobakterijos mirė dėl kokios nors priežasties.

Gaminant genetiškai modifikuotus augalus naudojant agrobakterijas

Pasirodo, Vir-regiono genai perneša į augalo ląstelę visas DNR sekas, kurios yra tarp dviejų 25-nukleotidų pakartojimų. Genai iš T regiono vis dar neveikia agrobakterijų ląstelėse. Todėl "Agrobacterium" gali būti "suklastota": vietoj "įprastų" genų į T-DNĮ įtraukiami tie žmonėms reikalingi genai. Tada visa infekcijos sistema veiks, tačiau į gryną pateks visiškai skirtingi genai!

Tačiau įgyvendinant tokią atrodo panašią idėją kilo sunkumų. Pagrindinis yra Ti-plasmidų dydis, kuris neleidžia jiems izoliuoti nuo agrobakterinių ląstelių.Tada mokslininkai nusprendė suskaidyti Ti-plazmidę į dvi dalis: palikti Vir-zoną vienoje, o T-sritis kitoje (dabar maža). Plazmidė su Vir-regionu vadinama "pagalbininku" (arba pagalbininku, iš anglų kalbos. pagalba – padėti).

Mažą plastiką su dirbtiniu T regionu galima išskirti iš bakterijų ląstelių, išpjauti / klijuoti specialiais fermentais mėgintuvėliuose, įterpti pageidaujamus genus į T-regioną, o po to daugintis žarnyno lazdele (Escherichia coli) ir perduoti agrobakterijoms.

Taigi, kad nė viena iš plazmidžių "neprarandama", kiekvienas iš jų tiekiamas atsparių genų skirtingiems antibiotikams. Dabar, augant bakterijoms terpėje su tam tikru antibiotikų deriniu, galima pasirinkti ląsteles, į kurias pateko viena iš plazmidžių, arba abu.

Taigi, sprendžiamas praktinio darbo su Ti-plazmidės problema. Bet kaip suvokti, ar DNR buvo perkeltas iš T regiono? Galų gale, dabar auksino genai ir citokinino biosintezė nepatenka į ląsteles, o navikas negali formuotis.

Be dominančio geno (vadinamojo dominančio geno), atsparus genas trečiajam antibiotikui, kuris veikia augalų ląsteles, būtinai įtraukiamas į T regioną.Trečiadienį kartu su maistinėmis medžiagomis papildomai pridedamas auksinas ir citokininas, taip pat antibiotikai naujame derinyje: Agrobacterium ir augalų ląstelės miršta be įterpto T regiono, o genetiškai modifikuoti ląstelės išgyvena. Kaip jums atrodo, augalinių ląstelių dalijimui reikia auksino ir citokinino. Dėl to, kaleidų masė turi augti iš genetiškai modifikuotų ląstelių. Jame galima gauti naujų augalų, naudojant tuos pačius biotechnologijų metodus (žr. "Potencialas" Nr. 10).

Pav. 4 Gliukuronidazės reportero genas leidžia nustatyti iš mėlynos spalvos reakcijos, kad augalas yra genetiškai modifikuotas. Nuotrauka iš www.phys.ufl.edu

Visais darbo etapais būtų malonu tiksliai pamatyti, į kurias ląsteles pateko dirbtinė T-DNR. Tuo tikslu į T regioną įtraukiamas kitas žurnalistė. Pagrindinis reikalavimas – genų produktas neturėtų būti randamas įprastose augalų ląstelėse ir turėtų būti lengvai ir greitai aptiktas. Kaip šiandien žurnalistas, dažniausiai naudojami du genai: gliukuronidazė (iš bakterijų) ir žalias fluorescuojantis baltymas (iš medūzos). Gliukuronidazė suteikia spalvinę reakciją su sintetiniu medžiaga, kurioje genetiškai modifikuotos ląstelės dažomos tamsiai mėlyna spalva (4 pav.). Yra tik vienas trūkumas: ląstelės miršta su šiuo dažymu.Žalia fluorescuojantis baltymas šviečia, kai jis apšviečiamas šviesa tam tikro bangos ilgio, o ląstelės nemiršta (5 pav.).

Pav. 5 Žalia fluorescencinis baltymas kaip žurnalistas leidžia stebėti augaluose esančias gyvas ląsteles. Nuotraukos iš www.genomenewsnetwork.org

Ir tik paskutiniuose etapuose jie tikrina, ar dominuojantis genas dirba (paprastai reikia atlikti daugybę tam tikrų DNR sekų, RNR ir pačios svarbiausio geno baltymo produkto analizės).

Taigi bet kokioje genetiškai modifikuotoje augalijoje, be dominančio geno, yra "balastas" arba "genetinis šiukšlių dėžė", reprezentuojamas bent reporterio geno ir rezistencijos geno.

Įvairių gudrybių su įdomiu genu pagalba gali būti gauti augalai, kuriuose yra naujas baltyminis produktas, kuris anksčiau nebuvo augalų ląstelėse. Arba, atvirkščiai, galima "išjungti" bet kokį augalo geną, "priversti" jį dirbti kituose organuose ir audiniuose ir kt. Tai leidžia mokslininkams išsamiai ištirti augalo genomo darbą. Tačiau genetiškai modifikuoti augalai turi praktinių pritaikymų.


Like this post? Please share to your friends:
Parašykite komentarą

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: