E. coli ląstelės sugebėjo rasti ir sunaikinti atrazino herbicidą • Vera Bashmakova • Mokslo naujienos apie "elementus" • Genetika

E. coli ląstelės sugebėjo rasti ir sunaikinti atrazino herbicidą

Cheminė atrazino struktūra. Vaizdas iš en.wikipedia.org

Kiekvieno sintetinės biologijos mokslininko svajonė yra perprogramuoti ląsteles, kad jie galėtų savarankiškai atlikti sudėtingas užduotis – pavyzdžiui, sintezuoti arba, priešingai, suskaidyti kai kurias medžiagas. Palaipsniui ši svajonė prasideda: neseniai buvo sukurtos mutantinės E. coli ląstelės (Escherichia coli), kurie pripažįsta herbicidinį atrazinį, perkelia į jo lokalizacijos vietą ir sunaikina jį.

Kadangi atrazinas neturi nieko bendra su E. coli, darbas susideda iš dviejų dalių. Pirma, reikėjo "išmokyti" bakterijas atraziną atpažinti ir judėti jos kryptimi (šis judėjimas vadinamas pseudotaksiu, pagal analogiją su chemotaksiu). Antra, bakterijos turėjo gauti "ginklą sunaikinti" herbicidą (t. Y. Fermentus, kurie jį skaidino).

E. coli turi visą baltymų jutiklių sistemą, skirtą nustatyti įvairius chemikalus – aminorūgštis, dipeptitus ir cukrų. Iš esmės buvo įmanoma pabandyti perdaryti vieną iš jutiklių, kad jis reaguotų į atraziną, tačiau mokslininkai nusprendė eiti kitaip ir "vilkti" šį herbicidą, o ne baltymus, o RNR molekules.

Tam naudojama SELEX technologija.Šis atrankos būdas pasirenkamas iš gigantiškų (daugiau nei 1014 nariai) bibliotekos RNR sekas, kurios yra konkrečiai ir stipriai susietos su reikiamu ligandu (tokios RNR, DNR arba baltymų sekos vadinamos aptameriais; žr. "Aptamer"). Remiantis aptameru, sukurtos riboswitches – RNR sekos, nuo ligandų nepriklausomos reguliuoja genų ekspresiją be baltymų kofaktorių. Tada yra daugybė galimybių: galite priversti ląsteles į savo medžiagų apykaitą įtraukti svetimą medžiagą, išmokyti jas judėti tam tikrų molekulių kryptimi arba, atvirkščiai, "pabėgti" nuo jų ir pan.

Deja, dažnai atsitinka taip, kad ribosus jungiklis, gautas dėl labai panašios į ligandą aptamero, dėl kokios nors priežasties pasirodo "neveiksmingas" ir negali sukelti reikiamų reakcijų ląstelėje. Sunku prognozuoti aptamero "kompetenciją" šiuo klausimu. Todėl mokslininkai nusprendė gauti didelę aptamerių biblioteką su vidutine afiniteto atrazine, o ne ieškoti vieno didelės giminystės aptamerio.

Kitas – technologijos klausimas. Remiantis kiekvieno šios bibliotekos nariu, mes sukuriame ribontuką ir "siūtiname" jį kai kuriemsžinomas genas (tyrime panaudotas genas cheZatsakingas už ląstelių judrumą E. coli ir dalyvauja chemotaksijos procese šioje bakterijoje). Paversti trūkstamą cheZ (t. y. neturi šio geno ir negali judėti) Escherichia coli ląsteles, naudojant gautą ribojančių jungčių biblioteką ir jas išsklaidyti aplinkoje be atrazino. Jei riboswitch veikia, tada, kai nėra atrazino, ląstelės negali judėti; Todėl, iš visų bakterijų klonų, mes pasirenkame tik nemobilius. Po dviejų šio pasirinkimo ciklų prasideda antrasis etapas – trečiadienį išskirti klonai su atrazinu. Priešingai, jau tapo darbo ribos jungiklio ženklas mobilumas ląstelės.

Priėmimo riboswitch schema. a – naudojant techniką Selex mes sukuriame aptamerių biblioteką, turinčią vidutinį afinitetą ligandui nuo atsitiktinės RNR sekos ir "siūti" geną prie kiekvieno iš jų cheZ. b – mes pertvarkome trūkumus cheZ bakterijos, naudojančios gautą biblioteką. Pasirinkite nejudamai ląstelių kolonijos į aplinką be atrazino ir juda terpėje su atrazine. Vaizdas iš straipsnio diskusijoje Gamtos chemijos biologija

Todėl mes gauname tam tikrą skaičių ribinių jungčių. Reikia pasirinkti tą, kuris geriausiai veikia. Tam mes "siūkime" kiekvieną iš jų į specialų demonstracinį genu lacZ. Šis genas susideda iš dviejų dalių: transposazės regiono ir sekos, koduojančios beta-galaktozidazę (daugiau informacijos apie transposazes, žr.: "Augalai" užsiima genų "genominių parazitų" elementais, Elements, 2007 m. Lapkričio 26 d.). O tada – paprasčiausiai: kuo stipresnis beta-galaktozidazės kiekis esant atrazinui, tuo geriau ribosnutė veikia ląstelėje.

Pasirinkę geriausius iš visų riboswitches, mokslininkai nusprendė išsiaiškinti, kaip tai veikia. Elegantiškų eksperimentų serijoje jie galėjo parodyti, kad riboswitch veikla susijusi su vertimu, o ne su transkripcija. Be to, buvo įmanoma sukurti riboswitch darbo modelį. Iš pradžių, kai nėra atrazino, jo ribosomų surišančios vietos blokuoja atraziną prijungianti svetainė. Tačiau, esant atrazinui, ši svetainė pašalinama, RNR "sėdi" ant ribosomos ir prasideda baltymų sintezė.

Išnagrinėję, kaip veikia riboswitch, mokslininkai pradėjo antrąjį darbo etapą – jiems reikėjo rasti fermentą, kuris susiliečia su atrazine. Problemų nebuvo.Šis herbicidas teršia aplinką jau šešiasdešimt metų, ir daugelis mikroorganizmų išmoko ją sunaikinti. Šio darbo metu mokslininkai naudojo vieną iš gerai apibūdintų genų – AtzA kuris koduoja chlorhidrolazę, kuri paverčia atraziną hidroksiatiracinu. Skirtingai nuo atrazino, hidroksiatrazinas yra gana rami medžiaga. Tai nėra herbicidas, ir daroma prielaida, kad jis nekenkia žmonių sveikatai. Be to, daug geriau atrazina yra adsorbuotas ant žemės. Taigi, atrazino konvertavimas į hidroksiatiraciną gali būti naudingas užterštų dirvožemių atkūrimui.

Dabar lieka tik sukurti "magiškas" E. coli ląsteles, galinčias rasti ir išskaidyti atraziną. Mokslininkai juos modeliuodavo taip, kad geną Chez (kuris yra atsakingas už judėjimą ir chemotaksiją) kontroliuoja ribosus jungiklis, todėl jis veikia tik esant atrazinui. Tuo pačiu metu ir genas Атза (atrazino suskaidymas) ir žalias fluorescuojančio baltymo GFP genas (jis daro ląsteles daug pastebimos ir leidžia atskirti mutantines ląsteles nuo įprastų) nuolat išreiškiamas.

Norėdami išbandyti, kaip veikia bakterijos, mokslininkai išsibarstė juos į atraziną turinčią agaro terpę. Medžiaga buvo paruošta taip, kad atrazino skilimas ant jo susidarytų gerai matomus specifinius taškus.

Po inkubavimo per naktį, apvalios kolonijos formuojasi ant terpės paviršiaus, susidedančios iš kintančių šviesių ir tamsių žiedų. GFP fluorescencijos tyrimo metu mokslininkai nustatė, kad ryškius žiedus sudaro daugybė ląstelių, o tamsiose ląstelių srityse yra daug mažesnių, o taip pat, vertinant pagal terpės paviršių dėmeles, yra mažiau atrazino.

Manoma, kad šie žiedai yra tokie. Kai atrazine turtinga aplinka, ląstelės nusileidžia skirtingomis kryptimis, proporcingai jo koncentracijai. Sukurta apvalio kolonija. Joje yra daugybė ląstelių – tai reiškia, kad jie greitai sugeba išskaidyti atraziną, ir jiems nieko nereikia daryti. Tada labiausiai "gudrus" iš šių ląstelių sugeba nuskaityti toliau (dėl kurių ploto skersmuo padidėja) ir rasti naujų "atrazinių pagrindų" sau. Likusios ląstelės, vieną kartą be beatrazinų terpėje, praranda norą judėti, nes jei nėra atrazino, iš jų išnyksta pseudotaksis.Štai kaip kolonijoje atsiranda šviesi ir tamsi zona. Po kurio laiko atrazinas baigiasi išoriniu žiedu; tada ląstelės migruojasi toliau, todėl pasirodo nauji žiedai.

Be to, verta paminėti, kad kontrolinės bakterijos trūksta geno Атза (t.y., gali atsikratyti atrazino kryptimi, bet negali jo suskaidyti) sudaro tiesiog apvalias kolonijas be kintančių šviesių ir tamsių sričių ir be jokių dėmių, nurodant herbicido katabolizmą.

Ląstelių kolonijas, turinčias atrazino terpę, baltos spalvos (kairėje) ir ultravioletinių spindulių (dešinėje) šviesa. Aukščiau (a) – kontrolinių ląstelių kolonijos, kuriose yra Chez kontroliuojamas riboswitch, bet neturi Атза (t. y. tie, kurie gali rasti atraziną, bet negali jo suskaidyti). Žemyn žemyn (b) – ląstelių kolonijos, kuriose yra ir Chez ir Атза (ty tie, kurie sugeba rasti ir suskaidyti atrazines). Matoma, kad kontrolinėse ląstelėse kolonijoje nėra šviesių ir tamsių koncentrinių žiedų pakaitos. Vaizdas iš straipsnio diskusijoje Gamtos chemijos biologija

Visa tai rodo, kad eksperimentas buvo sėkmingas, o E. coli sugeba rasti ir sunaikinti atraziną – tai reiškia, kad yra didžiulių galimybių kovoti su aplinkos tarša,taigi sintetinės biologijos vystymui apskritai.

Žinoma, daugelis problemų nebuvo išspręstos. Pavyzdžiui, E. coli ląstelės "nemato" mažo koncentracijos atrazino ir todėl gali būti naudojamos tik labai užterštose vietose. Tačiau šis darbas yra tik pradžia, o vėlesniuose eksperimentuose bus galima "suvynioti" ląsteles. E. Coli į daugiau "atrazinochutkogo" būseną, arba naudoti kitokios rūšies bakterijų. Taip pat yra gana įmanoma, kad būtų naudinga "išjungti" ląstelių mobilumą ne priešingu atveju, o atvirkščiai, esant atrazinei, tada jos sukurs kolonijas jos kaupimosi vietose, tačiau, jei jos susidoros su jais, jos atsikratys savo verslo.

Šaltinis: Joy Sinha, Samuel J. Reyes, Justin P. Gallivan. Perprogramuotos bakterijos. / / Gamtos chemijos biologija (2010). V. 6. 464-470 psl. Doi: 10.1038 / nchembio.369.

Vera Bashmakova


Like this post? Please share to your friends:
Parašykite komentarą

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: