Sukurtas naujas genomo redagavimo fermentas. • Aleksandras Markovas • Mokslinės naujienos apie "Elementus" • Genetika, molekulinė biologija, evoliucija

Dirbtinės evoliucijos metodas sukūrė naują genomų redagavimo fermentą.

Pav. 1. Bazinis redagavimas: papildomos nukleotidų poros A • T pakeitimas G • C, neužvedant dvigubų spragų į genomo DNR. a – Iš 32 000 žinomų žmogaus atskirų nukleotidų pakaitalų, kurių patologinis poveikis pasireiškia, beveik pusė (48%) koreguojama pakeičiant A • T ir G • C. b – pakeiskite A • T su G • C adenino (A) deaminimu. Tuo pačiu metu adeninas virsta inozinu (I), kuris yra "perskaitomas" polimerazės fermentais kaip guaninas (G). c – molekulinio prietaiso schema, skirta pakeisti A • T su G • C be dvigubų DNR pertraukų. Įrenginys susideda iš mutantinio Cas9 baltymo, kuris negali daryti dvigubų pertraukų, bet kuris žino, kaip iškirpti vieną iš dviejų DNR grandinių (Cas9 mikozė). mėlyna), vadovas ar vadovas, RNR (sgRNR, parodyta žalia), kurio nukleotidų seka atitinka genominės DNR (genominės DNR) sritį, kurią reikia redaguoti (Protospacer), ir fermentą, galinčią dezamuoti adeninus DNR (hipotetinės deoxyadenosine deaminazės, parodyta raudonai) Šis kompleksas susijungia su norima genomo DNR sritimi, Cas9 sulygina dvigubą spiralę ir išpjauna vieną iš grandžių, o fermentas adenozino deaminazė paverčia adeniną į inoziną kitoje grandinėje.Po to atsiranda iškirptųjų siūlų taisymas, kurio metu citozinas (C) yra priešais inoziną. Vėliau replikacijos metu prieš citoziną bus pristatytas guaninas (G). Taigi pora A • T virsta G • C. Paveikslėlis iš aptariamo straipsnioGamta

Pagal CRISPR-CAS sistemą sukurtų genomų redagavimo metodai reiškia, kad abiejų genomo DNR grandinių pjovimas, po kurio atliekami dvigubų spragų taisymai, kurių sudėtyje yra klaidų. Alternatyvus metodas – "bazinis redagavimas" (bazinis redagavimas) – yra chemiškai modifikuoti nukleotidus, nesukeldamas dvigubų spragų. Metodas jau buvo sukurtas C • G poroms konvertuoti į T • A, naudojant fermento citozino deaminazę, pridedamą prie modifikuoto Cas9 baltymo. Reversiniam transformavimui (T • A iki C • G) reikalingas adenozino deaminazės fermentas. Problema ta, kad nė vienas iš žinomų adenozino deaminatų negali dirbti su DNR. "Bioenginieriai iš Harvardo universiteto įveikė šią kliūtį, sukūrę būtiną fermentą dirbtiniu evoliucija. Dėl šios priežasties "redagavimo bazių" galimybės smarkiai išsiplėtė: dabar labai tiksliai ir su šalutiniu poveikiu mažiausiai galima atlikti visus keturis perėjimus gyvose ląstelėse, ty nukleotidų pakaitaluose C → T, G → A, A → G ir T → C.

"Elementai" daugiau nei vieną kartą sakė apie CRISPR-Cas sistemą, kuri yra atsakinga už paveldimą įgimtą bakterijų ir archeos imunitetą ir apie technologinį proveržį genomo redagavimo srityje, kurį sukūrė jo atradimas (išsamesnės informacijos žr. CRISPR pirmąjį dešimtmetį, "Elementai", 2014-07-13).

Populiariausi dabar genomo redagavimo sistemos yra pagrįstos Cas9 baltymo deriniu su trumpu vadovu arba gairiu, RNR (gRNA). Šis kompleksas yra pridedamas prie genominės DNR, kur nukleotidų seka sutampa su gRNR seka. Taigi, sintezuojant gRNA su skirtingomis sekomis, Cas9 gali būti nukreiptas į genomo DNR sritį, kurią norime redaguoti. Galimi ir kiti variantai. "Cas9" originali "laukinė" versija išpjauna abi DNR dvigubo spiralės sruogeles nurodytoje vietoje. Po to, ląstelių DNR atkūrimo sistemos bando pataisyti dvigubą pertrauką, jei įmanoma, naudojant homologines DNR fragmentus kaip matricą, skirtą apgadintam plotei ištaisyti. Jūs galite į ląstelę patekti dirbtinę matricą ir taip pasiekti norimus pakeitimus sutvarkytos seka.

Tačiau dvigubų spragų gydymo procesas yra kupinas klaidų (ypač nenormalus įterpimas, dažniausiai pasitaiko nukleotidų kritulių – Indelis, žr. Indelį). Todėl mokslininkai bando rasti tikslesnius genomo DNR redagavimo būdus, kurie nėra susiję su dvigubų spragų sukūrimu. Tam naudojamas mutantinis variantas Cas9 su nikaznoy veikla (nikaza yra fermentas, kuris pjauna tik vieną iš dviejų dvigubos spiralės sruogų, žr. Nickase). Tuo remiantis buvo sukurtas bazinio redagavimo metodas (bazinis redagavimas), kuris leidžia tiksliai pakeisti papildomą bazinę porą C • G ir T • A. Šiuo tikslu Cas9 mutantas yra sujungtas su kelių aminorūgščių liekanų "tiltu" su fermento cidutidine deaminase (žr. Cytidine deaminazę). Šis fermentas virsta citozinu (C) į uracilą (U), kuris, transkribuojamas ir replikuojamas, "skaitomas" polimerazės fermentais, tokiais kaip timinas (T). Antroji papildoma DNR grandinė nukirsta Cas9 baltymu, o šios grandinės taisymo (taisymo metu) adreno (A) vieta yra prieš uracilą. Techninis sunkumas yra tai, kad paprastai uricilas neturėtų būti DNR dalis. Atsparumo fermentai atidžiai stebi, ar DNR nėra uricilų, ir, jei jie yra randami, jie bando iškirpti "defektų" fragmentą ir atstatyti jį ant papildomos DNR grandinės matricos.Todėl norint, kad "pagrindinio redagavimo" sistema tinkamai veiktų, prie jo pridedamas kitas komponentas – fermento inhibitorius, kuris nukerpia uricilus iš DNR.

Taigi, iki šiol egzistuoja molekulinė struktūra, leidžianti gana tikslią papildomą C • G porų pakeitimą T • A genomei. Bet atvirkštinis pakeitimas (T • A su C • G), kuris buvo vienodai tikslus ir be dvigubų spragų, vis dar negalėjo padaryti. Tuo tarpu tik toks pakaitalas yra reikalingas 48% žinomų žmogaus nukleotidų polimorfizmų su patologiniu poveikiu ištaisyti (1 pav., A). Faktas yra tai, kad C → T mutacija vyksta dažniau nei kiti dėl spontaninio dezaminacijos citozino, o remonto sistemos ne visada sugeba laiku ją ištaisyti.

Šį atotrūkį užpildė pagrindiniai specialistai iš Harvardo universiteto (JAV); preliminari jų straipsnio versija, paskelbta žurnalo tinklalapyje Gamta Spalio 25 d.

Pagrindinis sunkumas, kurio jiems prireikė įveikti, buvo gamtinių fermentų trūkumas, galintis dezinfekuoti adeninus DNR. Jei toks fermentas egzistuotų, jis gali būti naudojamas sukurti sistemą, panašią į sukurtą, kad transformuotų C • G į T • A.Tokios sistemos veikimo principas parodytas fig. 1, c. Adenino dezaminavimas paverčia jį inozinu (I), kuris yra "nuskaitomas" polimerazėmis, tokiomis kaip guaninas (G). Vis dėlto visi žinomi adenozino deaminatai veikia ne su DNR, bet su RNR arba su atskiromis nukleotidomis, kurios nėra polimero grandinės dalis. Pavyzdžiui, E. coli Escherichia coli yra TadA fermentas – adenozino deaminazė, kuri veikia su vieno grandinės RNR, paverčiant A-I arginino transportavimo RNK antikodonu.

Pirmiausia autoriai, tikėdamiesi sėkmės, bandė paprasčiausiai paimti anksčiau sukurtą konstrukciją, kad transformuotų C • G į T • A ir pakeistų jį cytosine deaminase vienam iš natūralių adenozino deaminatų. Modifikuota konstrukcija buvo įvesta į žmogaus HEK293T ląstelių kultūrą (žr. HEK 293 ląsteles) kartu su nukreipiančia RNR, kuri nukreipė Cas9 į konkrečią vietą žmogaus ląstelės genome. Po to buvo patikrinta, ar pora T • A buvo pakeista C • G nurodytoje vietoje.

Autoriai išbandė keturis adenozino deaminatus (vieną pelę, du žmones ir vieną bakteriją – TadA, minėtą aukščiau), tačiau nieko iš to nepadarė. Nustatyta, kad natūralūs adenozino deaminatai netinka DNR modifikacijai. Tačiau tai nesustabdė mokslininkų.Jie nusprendė gauti fermentą, kuris nerodė natūralios evoliucijos naudojant dirbtinę evoliuciją.

Dėl to pagamintos modifikuotos bakterijos. E. coli su defektuoto antibiotikų atsparumo genais. Tokiuose genuose, kurie trukdo apsauginiam baltymui, ir įterpiant C su T arba G su A, buvo įvestos taškų mutacijos. Siekiant ištaisyti tokią mutaciją ir atstatyti apsauginio baltymo funkcionalumą, būtina pakeisti papildomą T • A ir C • G. pora.

Tada į šias bakterijas buvo įvestos plazmidės, koduojančios adeninų redagavimo molekulinio prietaiso prototipą: "Cas9" baltymas (trūkstantis galimybės kurti DNR spragas) su TadA adenozino deaminase, prijungtu prie jo. TadA geno anksčiau buvo įvestos įvairios atsitiktinės mutacijos. Toje pačioje plazmidėje buvo įdėtas orientacinės RNR genas, kuris turėjo "adenino redaktorių" išsiųsti į apsauginio baltymo geno dalį, kurią reikia redaguoti.

Po to bakterijos buvo veikiamos antibiotikais. Idėja buvo ta, kad ląstelės, kuriose "adeninų" redaktorius dirbo, išgyvena, o visi kiti mirs. Tai leis rasti tokias TadA mutacijas, kurios leidžia šiam fermentui dezinfekuoti adeninus DNR bent minimaliu efektyvumu.

Pirmasis dirbtinio evoliucijos etapas atskleidė dvi aminorūgšties pakaitalus, suteikiančius TadA galimybę retkarčiais konvertuoti adeninus į inozinus bakterinio genomo. Dizainas, kuris apima TadA su šiais dviem pakaitalais, yra vadinamas ABE1.2 (adeno bazės redaktorius, versija 1.2). Konstruktas buvo išbandytas ant žmogaus HEK293T ląstelių. Tuo pačiu metu į jį buvo pridėtas branduolio lokalizavimo signalas, kad chimerinis baltymas būtų pristatytas į branduolį, taip pat Cas9 variantą su plika veikla, kuris geriau tinka dirbti su eukariotine DNR. Vadovaujami RNR buvo naudojami, nukreipiant "adenino redaktorių" į šešis skirtingus žmogaus genomo taškus.

Dėl to tikslinės poros T • A buvo pakeistos C • G 3.2% atvejų. Rezultatas gali atrodyti nepaprastai įspūdingas, bet tai tik pradžia. Po to vyko nauji dirbtinio evoliucijos etapai, leidžiantys žymiai pagerinti "adenino redaktorių". Kiekvieną kartą pasirinkus bakterijas (ir pasikeitę tiek apsauginiai genai, tiek antibiotikai, ir apsauginių genų mutacijos, kurias reikėjo redaguoti), ir bandymai su žmogaus ląstelėmis.

Tarp atrankos etapų autoriai naudojo "protingą dizainą", analizuodami rezultatus ir bandydami išsiaiškinti, kaip dar pagerinti redaktoriaus efektyvumą. Kai kurie takai buvo užblokuoti.Pavyzdžiui, pasirodė, kad inozinai, kurie pasirodo genomo DNR, beveik visiškai nepaisomi remonto sistemų (skirtingai nuo uracilų), todėl papildant priemones, skirtas apsaugoti inoziną nuo remonto, sistema nieko nedaro. Tačiau kita idėja – pridėti antrą TadA kopiją dizainui – pasirodė vaisinga. Matyt, faktas yra tas, kad natūralus TadA veikia su viena grandine RNR homodimero forma – kompleksu iš dviejų identiškų baltymų molekulių. Vienas iš jų "palaiko" RNR, o kitas dezinuoja adeniną. Matyt, modifikuotas TadA taip pat yra patogiau dirbti su viengubos DNR kaip dimeriu. Iš pradžių autoriai naudojo dvi identiškesnes TadA kopijas, bet tada nustatė, kad geriau naudoti laukinį TadA kaip antrą egzempliorių, ir padaryti pakeitimus, kurie padidintų DNR efektyvumą tik pirmojoje kopijoje.

2 paveiksle atsispindi laipsniškas "adenino redaktoriaus" tobulinimas keičiantis dirbtinės evoliucijos ir pagrįsto dizaino raundoms. Galų gale buvo gauta išplėstinė ABE7.10 versija, kurioje 53% atvejų buvo tariamai pakeista T • A ir C • G, o gana retai – "pervertinti", ty redaguoti kitus adeninius, išskyrus (arba vietoj) tikslą.Adenino redaktorius ABE7.10 puikiai tinka ir tokiose sudėtingose ​​situacijose kaip ir adenino keitimas, esantis šalia kitų adeninių (tai reikalauja papildomų raundų, kai bakterijų išgyvenimas priklausė nuo šio redaktoriaus sugebėjimo).

Pav. 2 Pakopinis TadA pagerėjimas kuriant adenoziną deaminazę, galinčią dirbti su DNR. Kairėje – "adenino redaktoriaus" versijos numeriai, iš pradinio ABE1.0 į pažangiausią ABE7.10. Skaičiai viršutinėje eilutėje – aminorūgščių padėtys, kuriomis susidarė pakitimai. Trečia stulpelis dešinėje parodo, kiek TadA kopijų buvo įtraukta į dizainą ir ar šios kopijos buvo tos pačios (Homodimer) ar skirtingos (Heterodimer). Paskutiniai du stulpeliai – "Bridge", jungiančio "Cas9", ir dviejų TadA kopijų ilgis. Paveikslėlis iš aptariamo straipsnio Gamta

Siekiant aiškumo autoriai parodė sėkmingą kai kurių žmogaus polimorfizmų, susijusių su įvairiomis patologijomis, redagavimą. Pavyzdžiui, du mutacijos gama-globinų genų HBG1 ir HBG2 promotoriuose suaugusiesiems gamina vaisiaus hemoglobino. Tai naudinga dėl beta-globinų (HBB) pažeidimų, įskaitant pjautuvo ląstelių anemiją.Padedant adenino redaktoriui ABE7.10, šios sąlygiškai naudingos mutacijos buvo įvestos į HEK293T ląstelių genomą, efektyvumas buvo 29% ir 30%.

Papildomi eksperimentai parodė, kad darbas ABE7.10 tikslumas ir patikimumas yra gerokai didesnis nei kitų genomo redagavimo metodų, kurie apima dvigubos DNR pertraukos sukūrimą. Tačiau pastarasis vis dar išlieka optimalus pasirinkimas, jei reikia nukleotidą išbraukti į genomą ar įdėti į jį. Tačiau, norint tiksliai pakeisti vieną purino bazę kita (A – G arba G – A), taip pat pakeičiant pirimidino bazes tarpusavyje (C – T arba T – C), atrodo, kad dabar atrodo geriausias būdas fondų redaktoriai. Dabar jie gali naudoti cheminį redagavimą, nedarant dvigubų spragų, atlikti visus keturis perėjimai (pirimidino taško pakaitalai pakeičiami į kitą pirimidiną ar puriną į kitą puriną; žr. perversmą), ty nukleotidų pakaitalai C → T, G → A, A → G ir T → C.

Net pats efektyviausias ir tikslus šiuolaikinis genomo redagavimo metodas vis dar toli gražu nėra šimto procentų veiksmingas ir absoliutus tikslumas. Bet jei mes prisimename, kad nuo dešifravimo CRISPR-CAS sistema buvo tik dešimt metų, pažanga negali nepavykti įtikinti.Aptariamas darbas yra svarbus žingsnis kuriant genominius redaktorius, kurie yra pakankamai patikimi, kad būtų galima naudoti paveldimoms ligoms gydyti.

Šaltinis: Nicole M. Gaudelli, Alexis C. Komor, Holly A. Rees, Michael S. Packer, Ahmed H. Badran, David I. Bryson ir David R. Liu. Žanro DNR be DNR skilimo programavimas Gamta. Paskelbta internete 2017 m. Spalio 25 d. DOI: 10.1038 / nature24644.

Taip pat žiūrėkite:
1) apibendrinti CRISPR tyrimo pirmojo dešimtmečio rezultatai, "Elements", 2013 07 13.
2) Konstantinas Severinovas. Redaguoti genomą su CRISPR / Cas9 (Postnauka).

Aleksandras Markovas


Like this post? Please share to your friends:
Parašykite komentarą

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: